顶复门寄生虫（如弓形虫、疟原虫）是著名的“细胞吸血鬼”，专性宿主细胞内寄生，可引发弓形虫病、疟疾等致命疾病。顶复门原虫的线粒体基因组极度精简，仅剩3个蛋白编码基因（cox1、cox3和cob）和一堆“碎成渣”的线粒体rRNA片段。这些高度碎片化的线粒体rRNA如何拼成功能完整的线粒体核糖体？这一谜题困扰学界多年。
2024年12月17日，中国农业大学联合首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所、瑞士日内瓦大学和法国波尔多大学团队，在《Nature Communications》（IF：14.7）发表题为“Apicomplexan mitoribosome from highly fragmented rRNAs to a functional machine”重磅研究，文章通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术、转录组、蛋白组、冷冻电镜结构解析等多学科方法，首次揭示了顶复门原虫（刚地弓形虫）线粒体核糖体的“分子拼图”奥秘，并且鉴定出四个具有AP2结构域蛋白在维持虫体线粒体核糖体结构和功能中的关键作用。该项研究为开发针对弓形虫和疟原虫的新型治疗策略提供了新的分子靶点。
凯发旗舰厅为该研究提供了定量蛋白组学分析服务。
研究对象：顶复门原虫代表—弓形虫（Toxoplasma gondii）和伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）
关键样本：条件性敲低（conditional knockdown）四个线粒体AP2蛋白（mtAP2-1至mtAP2-4）的转基因虫株
CRISPR/Cas9基因编辑、转录组测序技术（RNA-seq）、免疫共沉淀（IP）和质谱分析（MS）、定量蛋白组（LC-MS）、RNA免疫共沉淀测序（RIP-Seq）和冷冻电镜（Cryo-EM）。
AP2/ERF家族蛋白新角色：传统上在植物和顶复门原虫中充当调控基因转录的AP2/ERF家族蛋白，在顶复门原虫线粒体内转变为线粒体核糖体大小亚基的构成蛋白；首次发现AP2功能域可与RNA分子结合。
高度碎片化的线粒体rRNA组装：揭示弓形虫利用40多个mt-rRNA片段和122个核编码线粒体核糖体蛋白组装出完整功能核糖体的机制。
独特线粒体核糖体结构：通过单颗粒冷冻电镜技术，首次解析了顶复门原虫代表-弓形虫线粒体核糖体的高分辨率三维结构，为目前已报道的核糖体和线粒体核糖体中结构最为复杂的核糖体。
本研究通过生物信息学分析鉴定出在顶复门原虫中高度保守的四个具有AP2结构域蛋白（mtAP2-1至mtAP2-4），并利用CRISPR/Cas9基因编辑、免疫荧光实验（IFA）和Split-GFP技术，确认其定位于弓形虫线粒体基质。基因条件性敲低实验表明，mtAP2蛋白的缺失会显著降低寄生虫的复制能力。该生长缺陷可通过野生型的回补完全恢复。动物实验表明，感染mtAP2-2缺失的弓形虫虫株的小鼠能存活并产生长期免疫反应，而感染野生型或野生型基因回补株的小鼠则无法存活，证实了mtAP2-2在虫体毒力中发挥着关键作用。
图1 四个具有AP2功能域的蛋白在顶复门中高度保守。这四个蛋白定位于弓形虫的线粒体基质中，其与虫体胞内增殖和对小鼠致病性相关。
通过RNA-seq分析发现，mtAP2蛋白的缺失并未显著影响虫体乃至线粒体内转录水平，表明其不作为转录因子发挥作用。然而，mtAP2蛋白的缺失导致虫体线粒体内呼吸链复合体III和IV的亚基丰度显著降低（蛋白组学结果），线粒体形态异常（肿胀、扭曲、嵴减少），同时线粒体能量代谢功能下降。此外，回补实验表明，野生型mtAP2蛋白能够恢复敲低株的生长缺陷，而缺乏AP2结构域的突变体则无法恢复。这些结果表明，mtAP2蛋白对于维持呼吸链复合体III和IV以及虫体线粒体的功能至关重要。
图2 四个mtAP2蛋白在弓形虫中并不充当转录因子，但其对维持虫体线粒体的形态和功能至关重要
通过IP-MS技术发现mtAP2蛋白相互作用的线粒体核糖体蛋白。结果显示，mtAP2-1与小亚基（mt-SSU）蛋白特异结合，而mtAP2-2、mtAP2-3和mtAP2-4则与大亚基（mt-LSU）蛋白特异性结合。进一步的实验表明，在MgCl2存在的情况下，所有mtAP2蛋白均与大小亚基蛋白相互作用，确认它们是线粒体核糖体的组分。蔗糖梯度分离实验表明，mtAP2蛋白对线粒体核糖体亚基的完整性至关重要，任一mtAP2蛋白的缺失均会导致虫体线粒体核糖体亚基的解体。此外，通过RIP-seq技术鉴定出43个小RNA片段，其中17个属于mt-SSU，26个属于mt-LSU，并发现了7个新的小RNA片段。这些结果表明，mtAP2蛋白是线粒体核糖体的核心组分，对维持其完整性至关重要。
图3 四个mtAP2蛋白为虫体线粒体核糖体的构成蛋白
为了深入了解四个mtAP2蛋白在整个线粒体核糖体中的分子位置，通过大规模培养刚地弓形虫速殖子，并采用蔗糖梯度分离纯化和冷冻电镜技术解析其结构。结果显示，单独LSU的分辨率为2.89?，处于成熟线粒体核糖体中的SSU头部、SSU主体和LSU三个部分的分辨率分别为3.6?、3.29?和3.11 ?。研究发现，SSU比LSU更大，呈该物种所特有的延长的椭圆形头部。同时，大小亚基中均含有大量顶复门原虫所特有的核糖体蛋白。SSU包含两个富含蛋白质的区域，呈现扩展平台和极短的h44区域，其中A位点高度保守。研究还发现，刚地弓形虫线粒体核糖体大亚基的中央突起（CP）部分完全由蛋白构成，内部并不含有5S rRNA。弓形虫线粒体核糖体蛋白数目高达132个，其中近半数为顶复门原虫所特有蛋白。真核生物的线粒体核糖体通常含有2-3条线粒体核糖体RNA。弓形虫的线粒体核糖体RNA呈现高度碎片化，片段总数竟然高达40条以上。同时部分rRNA片段独特，在细菌核糖体rRNA中未找到对应片段，弓形虫线粒体核糖体RNA同时出现大范围“删减”，其总线粒体rRNA长度显著低于细菌核糖体。
图4 籍借单颗粒冷冻电镜技术首次解析了弓形虫线粒体核糖体的高分辨率三维结构
图5 弓形虫线粒体核糖体的蛋白构成及其呈高度片段化的线粒体核糖体rRNA片段
研究者通过结构分析确定了四个mtAP2蛋白在线粒体核糖体中的精确位置及其与线粒体rRNA片段的相互作用。mtAP2-1位于虫体线粒体核糖体小亚基的头与体连接处，与SSUB和SSUD片段相互作用；mtAP2-2位于大亚基的CP区域，与RNA11和LSUA片段相互作用；mtAP2-3位于新生成肽通道出口的外侧上方，与RNA13、RNA29和RNA38片段相互作用；mtAP2-4位于PTC下方的亚基内侧，与LSUA和RNA3片段相互作用。这些蛋白通过与rRNA片段的3'和5'末端结合，在线粒体核糖体成熟过程中对rRNA片段的组装起关键作用。此外，刚地弓形虫线粒体核糖体还富含RAP和HPR家族的RNA结合蛋白，主要位于线粒体核糖体分子的外围。这些发现表明，mtAP2蛋白不仅维持核糖体的结构完整性，还可能参与调节大小亚基的结合。
图6 四个mtAP2蛋白与线粒体核糖体rRNA片段相结合
本研究首次揭示了顶复门原虫线粒体核糖体的独特结构和分子组装机制，系统性地描述了高度碎片化的线粒体rRNA如何经由AP2家族转录因子演化而来四个mtAP2蛋白协同诸多其他线粒体核糖体蛋白（mtRPs）组装形成功能完备的蛋白翻译机器。本研究为线粒体核糖体的组装机制和适应性进化提供了新的理解，研究的突破性结果不仅填补了线粒体核糖体领域的关键空白，还为今后开发针对多种顶复门原虫寄生虫引发的疾病（包括弓形虫病和疟疾）的新型治疗策略提供了重要的分子基础。通过靶向线粒体核糖体的关键蛋白，未来有望开发出更高效、更特异药物，为全球弓形虫病和疟疾防治事业带来新的希望。
