藏族人对高海拔的适应是研究现代人类进化史上适应的理想模型，因为其环境控制的很好。在高海拔地区，高原反应（包括急性高山病、肺水肿和脑水肿等）较为常见，但藏族人群的患病率低于汉族人群，以往的研究主要集中在缺氧诱导因子（HIF）途径上。然而，这种适应性在种群规模上仍然不足。结构变异（SVs）在基因组生物学功能和人类进化适应中扮演重要角色，可以影响远程基因调控、基因簇扩增和强效适应性变化。然而，但人类基因中SV热点的分布模式仍不完全清楚。
2023年12月，中国人民解放军总医院何昆仑教授团队在期刊Nature Communications（IF=16.6）发表题为《Structural variants involved in high-altitude adaptation detected using single-molecule long-read sequencing》的研究论文，该研究构建了一个大规模的汉族和藏族人口的SV景观，揭示了SVs藏族人对高海拔适应的潜在作用。通过增强子报告基因，细胞敲除，DNA pull-down实验，研究发现藏族基因特性的缺失破坏了超级增强子，并下调了EPAS1的表达，揭示了基因调控回路重组在人类适应中的作用。凯发旗舰厅为该研究提供了DNA pull-down质谱检测分析服务。
文章题目：Structural variants involved in high-altitude adaptation detected using single-molecule long-read sequencing
发表期刊：Nature Communications
影响因子：16.6
发表时间：2023年12月13日
发表单位：中国人民解放军总医院
样本选择：320例人血液（201例汉族和119例藏族）用于ONT长读长测序；150例人血液（75例汉族和75例藏族，其中123例既测长读长又测短读长）用于短读长测序。
实验技术：单分子长读长测序，短读长测序，CRISPR/Cas9介导的基因敲除，RT-qPCR，DNA pull-down
这项研究使用了ONT（Oxford Nanopore Technologies）的PromethION平台对201个汉族和119个藏族个体的基因组进行了长读长测序，平均覆盖深度为20.24。每个样本通过cuteSV，sniffles和nanovar调用的SVs，并使用dbSVmerge将320个SV调用合并成最终的汉族和藏族SV调用集。在汉族人群中检测到了116,773个SVs，在藏族人群中检测到了94,312个SVs，总共检测到了136,257个SVs。这些SVs主要包括71,437个删除、56,799个插入、7198个复制和823个反转，平均每个样本包含19,272个SVs（图1b）。在50%的样本中，汉族和藏族种群中超过90%的SVs被捕获，表明，样本量足以描述汉族和藏族人群的SV景观。
通过手动验证、PCR验证和与其他平台（如PacBio、HiFi）的结果进行比较，来验证SV调用集的质量，结果显示，他们的SV调用集具有高质量。结果还显示，长读长测序平台在处理具有GC偏向性的基因组区域时也表现良好。与NGS相比，ONT平台在GC含量较高的区域中检测到了更多的SVs。最后，将SV调用集与其他公共SV集进行了比较，发现该研究扩展了东亚人群的SV调用集，增加了约43%的新SVs。此外，该研究还贡献了42,261个新的全局SVs，其中包括11,137个藏族特有的SVs和20,571个汉族特有的SVs。
总的来说，这项研究为汉族和藏族人群提供了高质量的SV调用集。
图1：119例藏族样本和201例汉族样本中SV的发现
SVs主要分布在重复区域（约67%在重复区域），如转座子和卫星重复区域。这可能是因为重复区域更容易发生非等位同源重组、复制滑脱和非同源末端连接等过程，导致SVs的产生。在各类重复元素中，SVs在SINEs、LINEs和LTRs中的分布比例分别为15%、8%和4%，而在卫星重复区域和简单重复中的比例分别为4%和21%（图2a）。不同类型的SVs在各类重复和功能元素中的分布存在偏差。例如，删除、插入和复制与SINEs和简单重复相关，而反转则与LINEs、SINEs、简单重复和LTRs相关。此外，SV的长度分布显示了两个明显的峰值，分别位于约300bp（Alu）和约6kb（LINE）。SVs在基因组中的热点区域也被揭示，这些热点区域是SVs密度极高的区域，与其他区域相比，它们更容易发生SVs。例如，C7orf50区域就与大量的SVs相关，表明这个区域容易发生DNA断裂和SVs的形成。SVs与基因表达的调控密切相关。由于启动子和增强子与SINEs相关，因此它们也与SINE相关的SVs相关。此外，删除、复制、插入和SINE相关的SVs在调控基因转录方面比其他类型的SVs更为重要。
图2 SV组成、长度频率和染色质分布
结构变异是一种基因组的变异形式，可以作为区分不同人群的一个重要特征。研究发现，汉族和藏族共同拥有74,828个SVs。通过主成分分析（PCA），汉族和藏族的SVs可以明显区分。当将PCA扩展到1KGP数据库中的其他人群（如非洲、美洲、东亚、欧洲和南亚人群）时，发现汉族和藏族与东亚人群关系密切，而与其他人群距离较远。这表明藏族在遗传上与汉族更接近，与其他人群相比，这两个人群可能来源于一个共同的祖先（图3a）。此外，通过混合分析和所有SVs的进化树分析，发现汉族和藏族在SVs上存在明显的分离（图3b）。层次聚类分析也显示，汉族和藏族具有民族特异的SVs和共同的SVs。基于也清楚地显示了汉族和藏族之间的分离（图3c）。
这些结果表明，除了单核苷酸多态性（SNPs）外，SVs也是区分遗传上密切相关人群的一个稳健的代表性特征。
图3 汉族和藏族群体遗传学
本文研究了藏族人适应高海拔环境的基因组信号，藏族人适应高海拔环境的基因组信号是由SNPs、InDels和SVs协同作用所实现的。通过深度短读长测序和长读长测序数据的综合分析，在EGLN1和EPAS1等基因区域中发现了明显的进化选择信号。在藏汉人群的差异研究中，筛选了FST>0.1的SVs，发现了240个SVs，其中19个是新颖的，169个在藏族人中的频率高于汉族人（图4b）。这些SVs可能与高海拔适应性相关，特别是EGLN1基因中的一个插入物与先前报道的高海拔相关性一致。SVs可以通过改变顺式调控电路来实现广泛的远端调控，作者发现52%的SVs与增强子、沉默子或拓扑关联域（TAD）边界重叠，进一步表明了SVs在调控网络中的重要性。
深入研究了17个FST>0.2的SVs，包括3个新颖的SVs，这些SVs附近的蛋白编码基因与缺氧反应、炎症、葡萄糖、脂质和能量代谢、胰岛素受体信号传导、血液凝固和角蛋白丝等生物学特性有关。特别是dbsv66240 SV破坏了一个超级增强子，下调了EPAS1的表达，这是藏族人中最强的特异性信号，表明SVs在高海拔适应性中的重要作用。这些结果表明，这个SV与这些SNPs和InDels协同作用，影响高海拔适应性。此外，EPAS1和TMEM247在藏獒中也受到正向选择，并显示出不同的关联信号，表明它们都对适应性有功能贡献。
图4 汉族、藏族种群比较揭示进化适应的遗传景观
研究了藏族人群体中的两个特定结构变异（SVs）：dbsv66240的删除和dbsv124029的插入，以及它们对生物学功能和适应性的影响。研究发现：dbsv6620删除涉及基因调控增强子和启动子，可能在肾脏细胞中发挥顺式调控作用，影响缺氧反应相关基因的表达，如EPAS1。该删除还通过反式调控电路影响基因转录活性，改变了与转录因子结合的基因组区域，从而可能下调基因表达。通过DNA pull-down实验，发现202个结合蛋白，包括转录因子、中介复合物和锌指蛋白。GO分析显示，与dbsv66240序列结合的蛋白质主要富集在与转录共调节因子结合、转录共激活因子结合和DNA结合转录阻遏活性等分子功能相关的类别中。另一方面，dbsv124029插入与藏族人的长寿、睡眠质量和情绪有关，位于C7of50和ZFAND2A之间，且位于与失眠症状和舒张压相关的遗传区域内，并可能通过复杂的顺式和反式调控电路影响相关基因的表达。这些发现表明，藏族人中最具特色的SVs通过重塑与高原适应相关的基因表达，对适应性表型差异有所贡献。研究还发现了与藏族人头痛发生率、脂质代谢、跟骨密度和出生体重相关的基因变异。例如，位于TIMD4基因内含子中的一个变异可能会影响TIMD4的表达，从而影响头痛发生率，同时也与甘油三酯、低密度脂蛋白（LDL）胆固醇和总胆固醇水平有关。此外，研究还发现了一些功能不明的基因变异，这些变异可能与学习、发声行为、突触前组装和自闭症等相关。
这些发现揭示了藏族人通过基因变异来适应高海拔地区的环境压力，增进了对人类适应性进化的理解，也提供了新的视角来研究其他复杂的人类性状和疾病。
图5 藏族高原适应基因的进化选择
该研究通过对320例藏族和汉族样本进行长读长测序，破译结构变异在高海拔适应中的作用，发现基因间缺失通过破坏超级增强子来下调EPAS1的证据。
