癌症一直是人类健康的主要威胁之一。在众多癌症驱动的基因中，KRAS的地位尤为突出。KRAS基因突变与多种癌症的发生密切相关，特别是在胰腺导管腺癌（PDAC）中。KRAS通过激活RAF-MEK-ERK信号通路促进肿瘤生长，但ERK（细胞外调节蛋白激酶）的具体作用尚不完全清楚。最近，一项突破性研究为我们理解KRAS在癌症种的作用提供了新的视角。
2024年6月7日，北卡罗来纳大学教堂山分校的Channing J. Der研究团队和Clint A. Stalnecker团队，在《Science》（IF=44.7）上发表了题目为“Determining the ERK-regulated phosphoproteome driving KRAS-mutant cancer”一项突破性研究，通过磷酸化蛋白质组学技术，系统性地鉴定ERK在KRAS突变型癌症中的磷酸化底物，以揭示ERK如何支持肿瘤生长。
MIB-MS：用ERK抑制剂处理1或24 h的6个KRAS突变细胞系，每组3重复；
磷酸化蛋白质组：用ERK抑制剂处理1或24h的6个KRAS突变细胞系，每组4重复；
突变体构建+功能实验+转录组检测ERK对KRAS突变胰导管腺癌细胞系生长和转录本的影响；
磷酸化蛋白质组+蛋白质组+生物信息学分析与激酶网络构建评估ERK抑制剂引起的磷酸化网络变化。
本研究主要探讨了MEK1和ERK2在KRAS突变型PDAC细胞中的作用。研究发现，激活的MEK1而非AKT1，导致PDAC细胞对靶向突变KRAS药物产生抗性。ERK在癌症中通常没有激活突变，可能是因为单点突变不足以完全激活ERK，使其作为较弱的致癌基因。通过在KRASG12D突变型PDAC细胞系中表达持续激活的ERK1和ERK2变异体，发现这些变异体能够显著诱导ERK底物FRA1的磷酸化，并且使细胞对MEK1/2抑制剂产生抗性，但对ERK1/2选择性抑制剂SCH772984保持敏感。此外，通过siRNA介导的ERK1或ERK2急性抑制研究，发现ERK1和ERK2在促进KRAS依赖的PDAC生长中功能冗余，而非具有独特功能。这些发现支持了ERK1和ERK2在维持肿瘤生长中的冗余信号输出。
图1：ERK信号对于KRAS调控的PDAC生长至关重要
使用选择性ERK抑制剂SCH772984对6株KRAS突变的PDAC细胞系进行了1h和24h处理，并进行了多重激酶抑制珠质谱（MIB-MS）和LC-MS/MS磷酸化蛋白组学分析。结果显示，共检测到13646个不同的磷酸化位点，其中932个和4288个分别在1h和24h时差异调节。与现有的ERK底物汇编相比，本研究中的PDAC ERK依赖性磷酸化位点和蛋白质重叠度较低。此外，与临床PDAC患者的蛋白质组和磷酸化蛋白质组数据相比，本研究结果表现出更高的一致性，并在不同癌症类型和物种中验证了其普遍性和可靠性。
图2：KRAS突变体PDAC中ERK调控的磷蛋白组学
通过免疫荧光染色和ERK激酶活性报告基因(EKAR4)的方法，发现，ERK抑制剂处理显著降低了细胞核内外磷酸化ERK（pERK）的水平，并减少了ERK底物MYC的表达。
进一步分析ERK依赖的磷酸化蛋白质组，揭示了ERK调控的磷酸化蛋白在亚细胞水平上的不同分布和变化，这些蛋白与细胞骨架、细胞周期、细胞复制、RHO GTP酶信号传导和RTK激活等关键细胞过程相关。特别是，这些磷酸化蛋白中富含ERK对接序列（如DEF和D基序）和磷酸化基序[S/T]-P，这些序列对于ERK与底物的特异性结合和亲和力至关重要。通过构建并表达ERK1/2突变体，进一步揭示了ERK与D和DEF基序的相互作用在介导ERK信号传导以及对KRAS依赖生长的重要性。
图3：ERK磷酸化蛋白组调节由富含ERK结合基序的蛋白质组成的多种功能途径
ERK参与调控基因转录、蛋白质磷酸化和蛋白质稳定性，影响广泛的蛋白质类别，包括表观遗传调控因子、转录因子和激酶等，这些蛋白的磷酸化状态受到ERK的调控，并驱动ERK依赖的信号传导。ERK抑制导致这些蛋白的磷酸位点数量显著减少。ERK抑制导致细胞周期依赖性激酶(CDKs)、MAPKs、糖原合成酶激酶(GSKs)和CDK样激酶(CLKs)等激酶家族的调节失常。特别是，ERK抑制后ERK1和ERK2的基序显著下调，而RSKs、MAPKs和CDKs等激酶在长时间抑制后也显示出调节失常。同时，还观察到一些之前未被确定为ERK的直接靶标的激酶，如HIPKs、CLKs和DYRKs，在ERK抑制后补偿性活性增加。尽管KRAS可以结合多个效应子，但ERK和KRAS调控的激酶之间差异很小，这强调了ERK在KRAS信号传导中的核心作用。
图4：ERK通过参与下游激酶调控动态磷酸化蛋白质组
通过GO、KEGG和Reactome数据库的分析，发现PDAC中ERK依赖的磷酸化蛋白质组与ERK通路数据库存在66%重叠，但一致性仅为33%。这些磷酸化蛋白质与RHO GTPase信号通路、染色质组织、RNA处理和G1/S细胞周期等过程显著相关，暗示了异常ERK激活在PDAC中的全面作用。进一步的研究揭示了短期抑制主要影响RHO GTPase和EGFR/MAPK信号通路，而长期抑制则影响细胞周期和有丝分裂等更广泛的细胞过程。特别是，RHO GTPase信号通路在长期抑制后由下调转变为上调，提示存在对ERK抑制的补偿机制。
网络分析揭示了三个与ERK抑制后的磷酸化变化相关的调控网络，特别是涉及肌动蛋白细胞骨架重组调节的激酶（如PKN1/2、PAK4/6和PDPK1）。通过免疫荧光显微镜评估，ERK抑制后肌动蛋白应力纤维增加，与磷酸化蛋白质组学分析结果一致，可能与RHO GTPase活性调节和YAP1-TEAD激活相关。
图5：ERK信号与RHO GTPase信号高度集成
通过CRISPR-Cas9技术，在KRAS突变型PDAC细胞系中识别了1636个具有遗传依赖性的基因，并在磷酸化蛋白质组学数据集中检测到690相关基因，其中超过一半与ERK调控的磷酸位点有关。研究进一步揭示了这些基因产物在细胞核和细胞质中的分布，并特别关注了RHO GTPase及其效应子，以及RNA代谢和细胞周期组分（特别是M期和S期）在PDAC生长中的重要作用。此外，还探讨了这些ERK调控的磷酸化蛋白质在KRAS突变型癌症中的选择性遗传依赖性，并发现了一些在KRAS突变型PDAC中特别关键的基因，如FRA1、MYC和p130CAS。最后，提出了一个模型，即ERK通过调节CDK1激活和细胞周期S期及M期进展的磷酸化蛋白质来推动PDAC生长。
图6：ERK依赖性PDAC磷酸化蛋白质组的遗传依赖性
ERK1和ERK2具有几乎相同的信号传导和转化输出，KRAS调节的磷酸化蛋白质组几乎完全由ERK驱动。
在2123种蛋白质上鉴定了4666个ERK依赖性磷酸化位点，其中79%和66%的位点在从前被认为与ERK无关，这大大扩展了ERK依赖型磷酸化位点的深度和广度，并揭示了ERK在癌症中更复杂的功能。
确定ERK控制一个高度动态和复杂的磷酸化蛋白质组，集中于细胞周期蛋白依赖性激酶调节和RHO GTPase。
建立了ERK驱动KRAS-依赖性胰腺癌生长的最全面的分子图谱和机制。
参考文献
[1] Klomp JE, Diehl JN, Klomp JA, et al. Determining the ERK-regulated phosphoproteome driving KRAS-mutant cancer[J]. Science, 2024 Jun 7, 384(6700): eadk0850.
